Yirmibirinci yüzyıla girdiğimiz bu günlerde pandemik hastalıklarda olan artışlar, bioterorizm korkusu ve hastalıkların eradikasyon kampanyaları nedeniyle, aşıların şırıngasız ve iğnesiz uygulanabilmesi için çalışmalar hız kazanmıştır. Hızla gelişmekte olan dünyamızda iğne ile aşılama büyük sorunlara neden olmaktadır. Aynı iğnelerin tekrar kullanılması ile hepatit B, C ve HIV gibi kanla bulaşan mikroorganizmalar sıklıkla insanlara bulaşabilmektedir. Kontrolsuz yapılan enjeksiyonlarla her yıl 22.5 milyon hepatit B virus enfeksiyonu, 2.7 milyon HCV enfeksiyonu ve 98.000 bin HIV enfeksiyonunun insanlara bulaştığı hesap edilmektedir. Aşılama bu enjeksiyonların içerisinde çok küçük bir yer işgal etse de, günümüzde daha güvenli aşılama programlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu problemlerin çözümü için tek kullanımlık enjektörler üretilmiş, ancak bunların pahalı olması sebebiyle iğnesiz aşılama gibi başka yöntemlerin araştırılmasına neden olmuştur. Bu yöntemlerden transkutanöz immmünizasyon ve mukozal immünizasyon günümüzde en çok araştırılan ve üzerinde durulan konuların başında gelmektedir.

Transkutanöz immünizasyon

Transkutanöz immünizasyon aşı antijenini ve sıklıkla adjuvanı kapsar ve etkisini deride mevcut olan immün hücrelere penetre olarak gösterir. Geçmiş dönemlerde derimiz aşıların uygulanamayacağı bir bariyer olarak görülürken, günümüzde ise immünolojik organlardan biri olarak kabul görmekte ve yapılan çalışmalarda aşı uygulaması için uygun bir yol olduğu gösterilmiştir. Deri üç tabakadan oluşmaktadır: dış tabakada kornifiye olmuş ölü keratinositlerden oluşan stratum korneum; immün hücrelerden ve canlı keratinositlerden oluşan epidermis; ve epidermisi kan damarları, lenfatikler ve başka yapılarla destekleyip temeli oluşturan dermis. Epidermis’de kemik iliğinden köken alan ve derinin tüm yüzeyinin % 25’ini örten Langerhans hücresi olarak bilinen dentritik hücreler yoğun olarak bulunmaktadır. Langerhans hücreleri etkili antijen sunan hücrelerdir ve bu yüzden aşı uygulamasında primer hedef olarak kabul edilmektedir.
Transkutanöz immünizasyon genellikle patch yada benzer anlamda aşı antijenini ve   
adjuvan uygulanarak yapılır. Adjuvanlar aşı antijenlerine karşı immün sisteminin cevapını artıran  immün stimulan maddelerdir. İmmun sisteme antijen ve adjuvanların uygulanabilmesi için, keratinize olan stratum korneumun geçirgen olması gerekmektedir. Stratum korneumun geçirgenliği hidrasyon, abrazyon ve elektroporasyon gibi tekniklerle arttrılabilmektedir. Stratum korneuma bir antijen ulaştığında epidermal Langerhans hücreleri bunu alıp drene olan lenf noduna göç eder ve sistemik immün cevaba neden olurlar.

Sistemik ve mukozal immun cevap

Aktive olmuş Langerhans hücreleri inflamatuar sitokinler ve ko-stimulatör moleküller üreterek B- ve T- lenfositlerde etkili olan kuvvetli bir antijen-spesifik cevapa neden olurlar. Farelerde yapılan transkutanöz immünizasyonlarda koruyucu ve uzun süreli immun cevaplar elde edilmiştir. Bazı adjuvanlar antijene karşı olan antikor üretimini artırarak immün cevapı güçlendirebilirler. Hayvan deneylerinde transkutanöz immünizasyonla verilmiş olan adjuvanlar ile elde edilen antikorların fonksiyonel ve koruyucu olduğu gösterilmiştir. Mukozal immün cevap ile patojenin daha giriş yerinde engellenmesi kişide etkili bir koruma sağlanarak, sistemik immün cevap tamamlanabilir. Genelde mukozal yolla antijen verilmesi ile antijene karşı bir dereceye kadar mukozal cevap gelişir ve antikor cevapı antijenin verildiği mukozal yüzeyde en fazla olur. Örneğin nazal immünizasyon ile çoğunlukla akciğer ve nazal-ilişkili lenfoid dokularda immun cevap gelişir. Transkutanöz immunizasyon ile ağız boşluğu, akciğer, bağırsak ve kadın üreme sistemi gibi birçok yerde (hem IgM, hem de IgG) mukozal cevapa neden olur. Bu cevapa neden olan mekanizma tam olarak anlaşılmamıştır. Deriden dentritik hücrelerin sistemik ve mukozal kompartmanlara göçü, bu cevapı belki açıklayabilir. Escherichia coli’nın ısıya duyarlı enterotoksininin (LT) hem antijen hemde adjuvan olarak insanlarda kullanıldığı erken klinik çalışmalarda, LT’nin kendi başına serum, idrar ve guitada antikor yapımına neden olduğu gösterilmiştir. Bu anti-LT antikorlarının uzun süre kalıcı olması ve ikinci-üçüncü dozdan sonra rapel cevapa neden olduğunun gösterilmesi sayesinde, bu uygulama metoduyla ilgili önemli adımlar atılmasına yol açmıştır.

Stratum korneum penetrasyonu

Transdermal ilaç uygulamaları ile transdermal aşılama birbirinden farklıdır. İlaçların ve moleküllerin çoğu 500 Da’dan büyük olduklarından, dermal tabakadaki kan damarlarını geçmeleri mümkün olmamaktadır. Transdermal aşı antijenleri ve adjuvanları ile yüzeyel epidermis hedeflenmektedir ve bir milyon Da büyüklüğüne kadar rekombinant antijenler epidermise verilebilmekte ve kuvvetli bir immün yanıt oluşabilmektedir. Transkutanöz aşılamada stratum penetrasyonu için hidrasyon, mekanik olarak bütünlüğün bozulması veya her ikisinin beraber uygulaması yapılabilir. Stratum korneumun hidrasyonu derinin nemlendirilmesi ile mümkün olur. Keratinositler şişerek sıvının intersellüler alanda birikmesine neden olur. Bu işlem ile antijenlerin derien geçişi kolaylaşmaktadır. Fiziksel yada kimyasal olarak stratum korneum bütünlüğü bozularak penetrasyonun artırılması diğer uygulanabilen tekniklerdir. Hafif  abrazif aletlerle, örneğin yapışkan bantlarla  bu gerçekleştirilebilir. Farelerde yapılan bir çalışmada stratum korneumun bütünlüğünün bozularak transkutanöz verilmesi ile oluşan antikor cevapı toksoidin enjeksiyonla verilmesi ile benzer yada daha fazla olduğu görülmüştür. İnsanlarda LT içeren zımpara “patch”leri uygulanarak yapılan faz I çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Adjuvanlar

Transkutanöz immünizasyonda bağışıklık sisteminin güçlü yanıtı, antijenin yanında uygun adjuvanın verilmesine bağlıdır. Transkutanöz aşılamada en sık kullanılan adjuvanlar bakteriyel ADP-ribozil eksotoksin, kolera toksini (CT), Escherichia coli’nin ısı hassas enterotoksini (LT) ve onların mutantlarıdır. Bu adjuvanlar antijenlerinlerle beraber verildiğinde Langerhans hücrelerinin matür hücrelere dönüşmesine neden olan sinyalleri aktive ederler ve güçlü antijen sunan hücrelere dönüştürürler. CT veya LT’nin aşı antijenleriyle beraber verilmesi ile antijenlerin tek başına verilmesinden çok fazla antikor cevapı oluştuğu çalışmalarda gözlenmiştir. Örneğin enterotoksijenik Escherichia coli (ETEC)’nin rekombinant subunit aşısının güvenirliliği ve immünojenitesini değerlendiren bir çalışmada, gönüllülere transkutanöz “patch” ile ETEC kolonizasyon faktör CS6 tek başına yada LT ile beraber verilmiştir. Tek CS6 olan grupta aşılama ile immun yanıt oluşmamış, ancak LT ile birlikte verilenlerin % 68’inde CS6IgG ve % 53’inde anti-CS6IgA antikoru oluştuğu gözlenmiştir.

İmmün stimulan “patch”ler

Transkutanöz olarak adjuvanların verilmesi ile etkili bir immün yanıtın ortaya çıkması, enjeksiyonla verilmeye göre immün cevapı daha fazla artıracağı fikrini gündeme getirmiştir. Alüminyum içeren ürünlerin yan etkisinin fazla olması bu fikri destekleyen önemli olaylardan birisi olmuştur. Farelerde önce enjeksiyonla influenza aşısı uygulanmış, sonra aynı yere drene olan lenf nodunun olduğu bölgeye LT içeren immün stimulan “patch” yapıştırılarak, bu sayede daha kuvvetli antijen prezentasyonu, daha fazla serum influenza antikoru, daha fazla antikor yanıtı ve daha fazla hücre cevapı oluşmuştur.

Mikro iğneler

Mikro iğneler kullanılarak sadece deri penetrasyonu ile aşılama başka bir umut verici teknolojidir. Bu mikro iğneler 25 mm’den 1000 mm’ye kadar değişebilen uzunlukta olabilirler (Şekil-1a-b). İnsan epidermisi vücutta değişen derinliklerde olabilir. Avuç içleri insan derisinin en kalın olduğu yerlerdendir ve yaklaşık 1500 mm derinliğe sahiptir. Birkaç çalışma ilaçların transdermal uygulaması için mikro iğneler üretimine ve kullanımına odaklanmıştır. Solid mikro iğneler bazı ilaçların transportunu artırabilir. Son zamanlarda transdermal uygulanan mikro iğnelerle büyük moleküllerin transdermal dağılımını sağlayarak deri permeabilitesini artırabileceği görüşü benimsenmiştir. Uygulama ile ilgili yeterli tıbbi çalışma olmamasına rağmen, bu “patch”lerin kullanım kolaylığı bir avantajdır. Son klinik çalışmalarda katılımcıların hiçbirinin ağrı tariflemediği ve mikro iğnelerin stratum korneumu penetre edebilecek kadar uzun olmasından dolayı, minimal duyusal bir his tariflendiği görülmüştür. Ayrıca bu iğneler derin dokulardaki sinirleri uyarmayacak kadar kısadır.

                     
A                                                                    B
Şekil-1a-b: Değişik büyüklükte solid mikro iğneler                                 

Mukozal immünite

Aşılama programlarında iğne kullanılmadan başarıyla uygulanabilen tek yöntemdir. Vücudumuzun mukozal yüzeylerinin immünolojik organlardan zengin olması sayesinde, yabancı antijenlere karşı surveyans görevi görmektedir. Bunun için ağız, burun, akciğer, rektum, konjunktiva ve vajina gibi tüm mukozal yollar ve yüzeyler potansiyel bölgeler olarak kabul edilmektedir.

Sistemik ve mukozal immünite

Mukozal yüzeyler birçok organizmanın vücudumuza girerek enfeksiyonlara neden olduğu primer geçiş yerleridir. Birçok mekanizma mikroorganizmaların bu yüzeylerden geçişini engellemektedir. Bunlardan bir tanesi müköz bir sıvı salgılanarak fiziksel bir bariyer oluşturulması ve mikroorganizmaların çoğalmasını engelleyen ve öldürülmesini sağlayan lizozim ve laktoperoksidaz gibi maddeler üretilmesidir. Mukoza ile ilişkili spesifik lenfoid organlar (MALT) mukozayı zararlı antijenler ve asalak yaşayan mikroorganizmalardan korumaktadır. Solunum, gastrointestinal ve genitoüriner sistem mukozası MALT ile kümelenmiştir. Bu kümeler bronş ilişkili lenfoid organları (BALT), barsak ilişkili lenfoid organları (GALT) ve nazal ilişkili lenfoid organları kapsar.

Aşı uygulamasından sonra antijenler mikrofold M hücrelerinden aktarılarak MALT içindeki indükleyici kısıma gelirler. Burada dentritik hücreler antijeni T lenfositlere sunarlar. B lenfositler yüzey immün globulinleri ile, T lenfositler ise APC tarfından sunulan antijenleri T hücre reseptörleri (TCR) ile tanıyarak proliferasyon ve diferansiyasyon gösterir ve primer immün yanıtı oluştururlar. Bu bölgede oluşan sitokin profilinin de etkisiyle, plazma hücreleri özellikle IgA sınıfı antikorlar üretirler.
Membranöz hücre (M cell) adını alan hücreler spesifik immün sistem elemanlarının, yani B ve T lenfositlerin, daha mikroorganizma ile karşılaşmadan bu antijenlerle tanışmalarını ve primer immün yanıtı oluşturmalarını sağlayan çok özel hücrelerdir.

Oral aşılar

Oral uygulama için geliştirilen aşılar; polio ve rotavirusa karşı olan virus aşılarını, tifoid ateş ve koleraya karşı olan bakteriyel aşıları, yabancı antijenleri eksprese eden zayıflatılmış canlı  bakterileri ve yenilebilir transgenik bitki aşılarını içerir.

Canlı zayıflatılmış bir aşı olan oral polio aşısının global polio eradikasyonundaki başarısı diğer oral uygulanan canlı attenüe aşıların geliştirilmesi çalışmalrı için araştırıcıları cesaretlendirmiştir. Oral polio aşısısı gibi olan diğer iki aşı kolera ve tifoya karşı koruma sağlayan canlı zayıflatılmış bakteriyel aşılardır. Oral bir aşı olan Salmonella typhi Ty21a, 1970’lerde geliştirilmiş çok güvenli ve iyi tolere edilebilir bir aşı olarak görülmektedir. Tifoda etkinliği % 50- 80 ve aşılananların % 62- 78’inde 5-7 yıl koruyuculuk sağlar. Ty21a’ya ek olarak, tek doz uygulamaya olanak veren yeni oral aşılar geliştirilme aşamasındadır.

Bazı ülkelerde yaygın olarak kullanımda olan iki yeni oral kolera aşısı mevcuttur. Canlı bir aşı olan oral kolera aşı suşu CVD103-HgR, tek doz olarak uygulanan, % 62-100 koruyuculuğu, mükemmel bir güvenlik profili ve çok az yan etkisi olan canlı zayıflatılmış bir aşıdır. CVD103-HgR’nin virülans kazanma potansiyeli çok azdır ve bu da aşının güvenilirliğini arttırmaktadır. Canlı oral kolera aşısına ek olarak, cansız oral kolera aşısının da güvenilir ve immünojenik olduğu gösterilmiştir.

Yabancı antijenleri eksprese eden zayıflatılmış canlı bakteriler ve transgenik bitkiler (yenilebilir aşılar) oral aşılamada ümit verici iki gelişme olarak kabul edilmektedir. Oral aşı olarak kullanımda olan zayıflatılmış canlı bakterilerin güvenilir ve immünojenik aşı suşları, yabancı aşı antijenlerinin mukozal dağılımı için çok uygundur. Bu heterolog antijen uygulama platformlarını inceleyen bir çok çalışmada salmonella aşı vektörleri kullanılmıştır. Ayrıca birçok rekombinant salmonella aşısı şu anda klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Bu gibi aşılar, ya plazmidler üstüne kodlanan antijenlerin bakteriyel ekspresyonu ile yada yabancı genlerle  (DNA aşıları) immün sisteme heterolog antijenleri verirler. Salmonella typhi’nin doğal olarak sadece insanlarda bulunması bu aşının etkinliğini gösteren preklinik hayvan çalışmalarını sınırlamaktadır.

Transgenik bitkiler, bitki hücresinin rijid duvarı sayesinde antijeni sindirim sırasında mide asiditesinden koruyarak, ağızdan verilebilen ideal bir aşıdır. Bu aşıların diğer avantajları hayvan patojenleriyle kontaminasyonun önlenmesi, üretimin ucuz olması ve ısıya karşı stabil olmasıdır. Bitkiler içinde üretilmiş ve yenilebilir aşılar olarak çalışılan birçok antijen vardır. Bunlar arasında Norwalk virusu kapsid proteini gibi viral antijenler ve Escherichia coli enterotoksin subunit B (LT-B) gibi bakteriyel antijenler sayılabilir. Yeni yapılan bir çalışmada gönüllü insanlara LT-B eksprese eden transgenik patetes yedirilerek insanlarda bu tekniğin immünojenitesi gösterilmiştir. Çiğ olarak yenilmiş olan bu transgenik patatesler iyi tolere edilmiş ve verilen antijene karşı güçlü sistemik ve mukozal antikor cevapı indüklenmiştir.

Nazal aşılar

NALT hedeflenerek, burun yoluyla uygulanan birçok aşı geliştirilmiştir. Bunlardan bir tanesi canlı soğuğa-adapte trivalan influenza aşısı olup, tek kullanımlık bir alet vasıtasıyla burun deliklerinin içine sprey olarak uygulanabilmektedir. Bu aşı 5-49 yaş arası sağlıklı insanlarda kullanılmak üzere FDA tarafından ruhsat almıştır. Bu aşının etkinliği, immünojenitesi ve güvenliği ile ilgili olarak 15 aya kadar küçük çocuklar ve erişkinlerde çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmaların neticesinde aşının çocuklarda güvenli, iyi tolere edilebilen ve influenzaya karşı % 93 oranında etkili olduğu gösterilmiştir. Canlı influenza aşısının güvenliği ile ilgili önemli olan özelliklerinden birisi, nazofarengeal epitelyal hücreler dışında etkili bir şekilde replike olamamasıdır. A.B.D.’de intranazal kullanılan canlı attenue influenza aşısının güvenli olduğu gösterilmiş olsa da, İsviçre’de intranazal uygulanan inaktif influenza aşısı güvenlik kaygıları nedeniyle piyasadan toplatılmıştır. Bu inaktif aşı küçük miktarda potent bir adjuvan olan LT içermektedir. Ruhsatlandırma öncesi yapılan çalışmalarda ciddi bir yan etki bildirilmezken, ruhsat sonrası surveyans çalışmalarında Bell’s paralizisi ile aşı arasında bir ilişki bulunmuştur. İsviçre’de en son yapılan bir vaka-kontrol çalışmasında Bell’s paralizisi gelişen hastaların daha önceden piyasadan kaldırılan bu aşıyı kullandıkları ve bu hastalarda relatif riskin % 19 olarak hesap edildiği gösterilmiştir. Uzmanlara göre Bell’s paralizisi ve aşı arasındaki ilişkinin, muhtemelen LT’nin sinir lifleri tarafından adsorbe edildikten sonra retrograt transportu ve sonucunda nöronal hasara neden olduğu şeklinde yorumlanmaktadır. Bu tecrübeler nedeniyle, intranazal aşı uygulamalarında daha güvenli adjuvanlar geliştirmek için çalışmalar devam etmektedir.

Aerosol aşılar

Mukozal aşılamanın başka bir yolu olan aerosol aşılama, iğnesiz aşılamada ve özellikle çocuklarda kitlesel aşılamada umut verici bir yöntem olarak görünmektedir. Aerosol aşılama genellikle bir nebulizatör ile küçük partiküllerin akciğerlere ulaştırılmasını kapsar.  Aerosol aşılama sadece büyük populasyonların hızlı aşılanması için alternatif bir yol gibi görünse de, bioterorizm olaylarında ve gelişmekte olan ülkelerin kitlesel aşılama programlarında önemlidir. Bu yöntem kızamık gibi hava ile bulaşabilen ve aşı ile korunabilen bir çok hastalık gibi enfeksiyon gelişimindeki  doğal yolu izlemektedir. Bu aşıların olumlu yönleri tamamen ağrısız, invazif olmamaları ve sağlık personeli dışındakiler tarafından yapılabilmeleridir.

Aerosol aşılama 100 yıldan fazla bir süreden beri insanlar ve hayvanlarda kullanılmaktadır. Geçmişte birçok insan şarbon, veba, tularemi, suçiçeği, tetanoz ve botulizme karşı aerosol yolla aşılanmıştır. Bir bateri ile sağlanan akım vasıtasıyla canlı zayıflatılmış kızamık aşısının uygulandığı çalışmalar, aşılamanın en geniş olarak test edildiği klinik çalışmalar olmuştur. Bu alet parçalanmış buz içeren bir konteynerin içinde bulunarak kızamık aşısını içeren küçük bir nebulizatör kutusuna hava dağıtmaktadır. Aşı koni şeklindeki tek kullanımlık kağıt bir kupanın içinden geçerek nebulize olmaktadır. Aşılanan çocuğun ağzının ve burnunun üzerine kupa yerleştirilerek, tek kullanımlık bir maske gibi görev yapmaktadır. Bu metod ile 5 mm’den küçük partiküllerin alt solunum yollarına depolanması sağlanmaktadır. Bu yöntemin etkinliği ve güvenirliliği canlı zayıflatılmış kızamık aşısının aerosol yolla verildiği birkaç çalışmada değerlendirilmiştir. Güney Afrika’da okul çocuklarında uygulanan bir çalışma sonunda antikor cevaplarının aerosol uygulamada transkutanöz uygulamaya göre daha iyi olduğu gösterilmiştir. Meksika’da okul çoçuklarında kombine rubella ve kızamık aşısının kullanılarak aerosol ve subkutan uygulamanın karşılaştırıldığı başka bir çalışma yapılmıştır. Bu çalışmanın sonucunda rubella serokonversiyon oranının her iki uygulamada aynı olduğu, ancak kızamık serokonversiyonunun aerosol uygulamada belirgin derecede yüksek olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma ile kombine aşıların aerosol yolla uygulandığında birbirlerinin etkinliğini inhibe etmediği gösterilmiştir. Aynı çalışmadan çıkartılan diğer sonuca göre aerosol uygulamada ateş şikayetlerinin daha az olduğu görülmüştür.